Hoefer HE33 - Manuel (Page 23)

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Détection de l’ADN
ADN peut être détectée soit par la fluorescence de
bromure d’éthidium ou lié par autoradiographie d’ADN
radiomarqué.
Le bromure d’éthidium (0,5 µg/ml) peuvent être ajou-
tés à l’exécution de mémoire tampon pour surveiller
les progrès échantillon parce fluorescence du colorant
sous une lampe UV révèle emplacement bande. (Pour
vérifier les progrès, éteignez l’alimentation et retirez
le couvercle de l’unité d’agarose. Tenir une lampe UV
portative près du bac en cours d’exécution. Repla-
cez le couvercle et tournez sur la puissance pour
reprendre l’électrophorèse.)
Sinon, après électrophorèse, tacher le gel dans une
solution de bromure d’éthidium (0,5 µg/ml H
2
O)
pendant 15 à 60 minutes, puis voir ou photographier
l’échantillon sur un transilluminateur UV.
Pour photographier le gel, soit placer le plateau tour-
nant sur la surface transilluminateur ou faites glisser
le gel sur la surface pour une exposition maximale.
(Le plateau en cours d’exécution est de 95% trans-
parent à la lumière 302-nm et transparente à 40%
à 254 nm la lumière.) Voir l’échantillon sous une
lumière UV 366-nm ou réduit l’intensité de la lumière
UV 302-nm pour réduire photonicking.
Afin de réduire la fluorescence de fond de bromure
d’éthidium non lié, le gel peut être décoloré par
trempage pendant 5 minutes dans 0,01 m MgCl
2
, ou
pour 1 heure de 0,001 M MgSO
4
. Décoloration rend
plus faciles à détecter de petites quantités (moins de
10 ng) d’ADN. (Sambrook, section 6.15).
Bibliographie
Ausubel, et al., (eds). Current Protocols in Molecular
Biology. Greene Publishing and Wiley-Interscience.
New York (1993).
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecu-
lar Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Har-
bor Laboratory Press (1989).
Attention! Le bromure
d’éthidium est un mutagène
connu. Toujours porter des gants
lors de la manipulation.
Attention! Porter des lunettes de
sécurité UV et protègent la peau
lors de l’utilisation de n’importe
quelle source de lumière UV.
Remarque: Le bromure
d’éthidium ralentit migration de
l’ADN d’environ 15%.
Remarque: Réduire le temps de
coloration pour empêcher petits
fragments d’acides nucléiques à
partir des diffusante du gel.