Jenway Genova Plus French - Manuel (Page 16)

SECTION 3 – Théorie et pratique des mesures de
spectroscopie
3.1 THÉORIE DES MESURES DE SPECTROSCOPIE
La spectroscopie UV-visible est la mesure de l'absorbance de lumière à une longueur d'onde spécifique dans un
échantillon. Elle sert à identifier la présence et la concentration d'entités moléculaires à l'intérieur de l'échantillon.
La loi de Beer-Lambert sert à mettre en relation l'absorption de lumière avec les propriétés de l'échantillon à travers
lequel la lumière voyage. La loi de Beer-Lambert déclare que :
A est l'absorbance
est le coefficient d'absorption molaire (l mol -1 cm -1 )
c est la concentration (mol l -1 )
l est le trajet optique (cm)
Cette loi démontre que l'absorbance est linéaire par rapport à la concentration. Cependant, ceci n'est vrai que pour
les faibles concentrations. Pour des niveaux d'absorbance supérieurs à 3, la concentration commence à se s'éloigner
de la relation linéaire.
La transmission est la proportion de lumière qui passe à travers l'échantillon :
Par conséquent : T = I
t
I
o
L'absorbance est inversement reliée à la transmission :
A = log 1
T
3.2 DÉTERMINATION DE L'ACIDE NUCLÉIQUE
L'ADN, l'ARN et les oligonucléotides peuvent être mesurés directement dans des solutions aqueuses sous forme diluée
ou non. Les tampons aqueux présentant des concentrations faibles en ions (tampon TE, par exemple) conviennent
parfaitement pour cette méthode. La concentration est couramment déterminée par la mesure à 260 nm par rapport
à un blanc, puis par l'évaluation par rapport à un facteur.
Le Genova Plus dispose de méthodes prédéfinies installées qui s'appuient sur l'hypothèse que l'absorption de 1 OD
(A) est équivalente à environ : 50 µg/ml d'ADNdb, 37 µg/ml d'ADNsb, 40 µg/ml d'ARN et 30 µg/ml pour les
oligonucléotides.
L'interférence ADN par des contaminants peut être évaluée par le calcul d'un rapport d'absorption. Les rapports
A260/A280 et A260/A230 servent à estimer la pureté des acides nucléiques, car les protéines sont absorbées à
280 nm et les substances telles que les peptides, phénols, composés aromatiques ou glucides sont absorbés à
230 nm. L'ADN pur doit posséder un rapport A260/A280 d'environ 1,8 et l'ARN pur de 2,0. Dans les échantillons
d'acide nucléique pur, le rapport A260/A230 doit être d'environ 2,2.
Où :
I
o
est la lumière incidente
l
t
est la lumière transmise
L est le trajet optique
14
I
o
I
t
L