Hoefer IEF100 - Manuel (Page 61)

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3. Solution SDS tampon d’équilibration
Cette solution est utilisée après IEF, et avant PAGE deuxième dimension. Les
bandes IPG sont immergés dans la solution en excès pour élever le pH du
tampon de bande de sorte qu’il est apte à PAGE, et à revêtir les protéines en
SDS uniformément de telle sorte que leur migration correctement dans le gel
de seconde dimension.
Prépare 200 ml
6 M d’urée, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, glycérol 29,3%, 2% SDS, 0,002%
bleu de bromophénol
Concentration finale Montant
Urée (FW 60.06) M 6 72,1 g
1,5 M Tris-HCl, pH solution stock 8,8 75 mM 10,0 ml
Glycérol (87% w/w) 29,3% (v/v) 69 ml
SDS (FW 288.38) 2% (w/v) 4,0 g
Bleu de bromophénol 0,002% (w/v) 4 mg
l’eau déminéralisée à 200 ml
Aliquoter en 30 aliquotes ml et conserver à -20 °C ou au-dessous.
24 cm IPG exigent 5-10 ml par bande par étape d’équilibration. Plus
courtes bandes peuvent utiliser un volume proportionnellement moins par
étape d’équilibration.
Procédure d’équilibrage
1 Décongeler deux aliquotes de la solution d’équilibrage.
2 Ajouter 10 mg/ml TNT à une solution.
3 Placez les bandes IPG dans le plateau de réhydratation/équilibration.
4 Ajouter 6,5 ml de solution à chaque emplacement contenant une
bande IPG.
5 Place de bascule pour 10-15 minutes.
Après équilibration, jeter la solution d’équilibrage d’abord dans une manière
appropriée.
6 Ajouter 25 mg/ml iodoacétamide (AAI) à la seconde partie aliquote de
la solution d’équilibrage.
7 Ajouter 6,5 ml de solution à chaque emplacement contenant une
bande IPG.
8 Place sur le culbuteur pour 10-15 minutes.
Après équilibration, jeter la solution d’équilibrage deuxième d’une manière
appropriée.
Équilibrage suivant, les bandes IPG sont placés sur la surface du gel, la
deuxième dimension, et scellé en place avec la superposition d’agarose.
Remarque: les bandes IPG doivent
être équilibrés, juste avant PAGE
dimensin seconde. Ne pas équilibrer
les bandes IPG avant de le ranger à
-20 °C.