Hoefer IEF100 - Manuel (Page 57)

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Annexe B: Réactifs et solutions
Préparation de l’échantillon
Les échantillons préparés pour la 2D devrait être pleinement dénaturé,
exempt de matières insolubles, et faible en force ionique globale.
Certains échantillons de protéines aisément solubiliser tandis que
d’autres sont plus difficiles, nécessitant des réactifs supplémentaires (tels
que la thiourée, des détergents spéciaux, etc) afin d’encourager la solu-
bilisation. Les classes communes d’additifs sont énumérés ci-dessous.
Dénaturants
L’urée est le réactif le plus couramment utilisé dans IEF pour pertur-
ber la liaison interne de la protéine, ce qui lui permet de se dérou-
ler. Les échantillons sont préparés en utilisant des concentrations
d’urée de 8 à 9,5 M. En général, plus le la concentration d’urée de la
meilleure d’un échantillon peut être solubilisé. L’urée atteint son point
de saturation à près de 10 M à la température ambiante.
La thiourée est également utilisé afin de mieux solubiliser certains
échantillons. Fréquemment, M 2 thiourée est combiné avec de l’urée
5-7 M en tant que réactif pour la préparation d’échantillons et de la
réhydratation IPG.
Détergents
Plusieurs types de détergents non ioniques ou zwitterioniques peut
être utilisé pour solubiliser les échantillons (CHAPS, Triton X100, le
Nonidet NP-40, et des détergents alkylamidosulfobetaine). CHAPS est
le détergent le plus largement utilisé pour l’électrophorèse 2D. Il est
stable en solution. Détergents tels que le SDS ne sont pas compatibles
avec IEF, car ils se lient à des protéines et des protéines de charge
masquer des natale.
Réducteurs
Dithiothréitol (DTT) est couramment utilisé pour réduire les protéines
dans IEF. TNT se décompose en solution, de sorte qu’il est norma-
lement préparé et ajouté juste avant l’utilisation. Autres réducteurs
comme le 2-mercaptoéthanol, dithioérythritol (DTE) et de tributyl-
phosphine (TBP) peut être utilisé.
Autre
Ampholytes porteurs ou des tampons IPG peut être ajoutée pour faci-
liter la solubilité des protéines et aider à prévenir la précipitation des
protéines au cours de mise au point. Des concentrations de 0,5%-2%
(v/v) sont généralement utilisés. Ampholytes porteurs peuvent interfé-
rer avec certaines expériences de marquage. Dans ces cas, les réactifs
doivent alors être omis de l’étape d’extraction de l’échantillon.
Les classes ordinaires des additifs
Dénaturants
Déplier les protéines afin d’exposer les
charges internes indigènes.
Des détergents non ioniques
Assurez échantillons plus soluble sans
altérer la charge de protéines.
Réducteurs
Aide briser les liaisons disulfures
internes afin de déplier les protéines,
et aider à réduire les effets négatifs de
l’oxydation des protéines au cours de la
réhydratation et IEF.
Autre
Amphoytes transporteurs, des protéases,
DNases, des RNases.