Sonics VCX134 - Manuel (Page 20)

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Pour le traitement de cellules difficiles, telles que les levures, un pré-traitement par une
enzyme peut être bénéfique. Les digestions au lysozyme, hyaluronidase, glycosidase,
glucalase, lyticase, zymolase et lysostaphine font partie des méthodes enzymatiques les
plus fréquemment utilisées avec les levures et le lysozyme avec les bactéries. Un
traitement enzymatique est généralement suivi par une sonification dans un tampon de
lyse GITC. La collagénase peut être utilisée avec le collagène, la lysostaphine avec les
staphylocoques, et la trypsine hyaluronidase avec le foie et le rein.
Si l'utilisation d'enzyme n'est pas possible, les procédures suivantes peuvent être essayées :
congélation de l'échantillon à -70°C pendant la nuit, puis décongélation dans l'eau
immédiatement avant la sonification.
La plupart des tissus animaux peuvent être traités frais (non congelés). Il est important de
garder les tissus frais au froid et de les traiter rapidement (dans les 30 minutes) après
dissection. Si l'utilisateur travaille sur des tissus frais, les cellules doivent être soniquées
immédiatement au moment de l'ajout de la solution de lyse GITC. Ceci peut se faire en
versant la solution de lyse dans le tube, en ajoutant le tissus et en soniquant
immédiatement. Ne jamais laisser reposer les tissus dans la solution de lyse sans les
désintégrer. Les échantillons importants de tissus durs doivent d'abord être traités dans un
mixeur ou un homogénéisateur mécanique.
Les tissus animaux ayant été congelés après prélèvement doivent être désintégrés en les
broyant dans l'azote liquide avec un mortier et un pilon. Pendant cette procédure, il est
important de conserver le matériel et les tissus à des températures cryogéniques. Les
tissus doivent être secs et poudreux après broyage. Le broyage doit être suivi par une
sonification approfondie dans du tampon de lyse GITC. Cette façon de traiter les tissus
congelés est longue et fastidieuse, mais efficace.
Les cellules de culture sont normalement faciles à désintégrer. Les cellules cultivées en
suspension sont récupérées par centrifugation, rincées au PBS pour éliminer le milieu de
culture, puis lysées en les soniquant dans du tampon de lyse GITC. Placer le récipient sur
la glace pendant le lavage et la lyse des cellules pour améliorer la protection des ARN
contre les ARNases endogènes libérées pendant le processus de désintégration.
Les tissus végétaux mous et frais peuvent souvent être désintégrés en les soniquant dans
du tampon de lyse. Les autres tissus végétaux, comme les aiguilles de pin, doivent être
broyées à sec, sans azote liquide. Certaines matières végétales dures de type bois
nécessitent une congélation et un broyage dans l'azote liquide avant d'être traités par
ultrasons. Les cultures de cellules végétales en suspension et les cals sont généralement
soniqués dans un tampon de lyse en moins de 2 minutes. La diversité des plantes et tissus
végétaux rend impossible des conseils uniques applicables à tous. Cependant, la plupart
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