Hoefer PR625 Immunoblot - Manuel (Page 15)

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Étape 2.
Après gels sont effacés, les bandes sur la membrane
ne sont pas visibles. Ajout d’un colorant non-réactive,
il sera facile d’aligner la membrane. Cela peut être
fait dans l’une des deux façons suivantes:
A. Pour les charges plus importantes de protéines
(>250 ng) Ponceau S peut être utilisé pour colorer
protéines de façon réversible sur la membrane après
le transfert électrophorétique.
Rincer la membrane brièvement dans de l’eau et aux
taches de 0,2% Ponceau S pour 1 à 2 minutes, puis
décolorer plusieurs changements de l’eau distillée
jusqu’à bandes rouges apparaissent sur un fond blanc.
Depuis la tache est perdue lors de l’étape ultérieure de
blocage, des bandes de protéines devrait être marqué
à ce stade avec des trous d’épingle ou avec un crayon
pointu. Le transfert peut également être photocopiée.
Blots colorés Ponceau S peuvent être stockées pendant
des mois à 4 °C, maintenue humide entre des feuilles
de parafilm ou un tampon de papier filtre saturé. Blots
peut également être congelé dans un sac en plastique.
Poudre de Ponceau S devrait être dissous dans l’eau
distillée pour obtenir une solution de travail. La solu-
tion peut être réutilisée pour plusieurs semaines à
plusieurs mois selon le nombre de vitraux membranes.
B. Pour les charges en protéines plus faibles
(<250 ng), le vert de méthyle, pyronine Y ou Deep
Purple peut être utilisé pour baliser de façon perma-
nente le haut et le bas du gel pour l’alignement ulté-
rieur avec ImmunoBlot canaux.
Lors du chargement du gel, ajouter environ 5 µl de
vert de méthyle (0,1% de solution dans du glycérol
50%) ou pyronine Y (solution à 0,05% dans du glycé-
rol 50%) pour voies désirées. Ces colorants migrer
juste en avant du front de colorant bleu de bromophé-
nol dans le gel, et transférer de façon permanente à
la membrane. Un seconde partie aliquote du colorant
ajouté au gel vers la fin de la course électrophorétique
entrera dans le gel de résolution 5 à 10 minutes
et servent à marquer le sommet du gel. S’il vous
plaît gardez à l’esprit que ces colorants fluorescents
peuvent interférer avec les méthodes occidentales
de détection buvard et devraient donc être suppri-
més avant l’imagerie. Si à gauche sur la membrane
qu’elles donneront lieu à des signaux non spécifiques
dans la détection fluorescente Western blot.