Sonics VCX134PB - Manuel (Page 18)

Les bactéries Gram Négatives nécessitent généralement 10 à 15 minutes de traitement,
alors que les staphylocoques nécessitent 20 à 30 minutes.
Les micro-organismes sont très différents dans leur sensibilité à la désintégration
ultrasonique. Par exemple, les plus facilement désintégrés sont ceux en forme de bâtonnet
(bacilles), alors que les organismes sphériques (coques) sont beaucoup plus résistants. Le
groupe des mycobactéries, auquel appartient le micro-organisme responsable de la
tuberculose, est particulièrement difficile à désintégrer. Généralement, les cellules
animales sont plus facilement désintégrées que les cellules végétales, et les globules
rouges sont plus facilement désintégrés que les cellules musculaires, car ces cellules ne
possèdent pas de paroi cellulaire protectrice.
La désintégration cellulaire constitue la première étape pour l'extraction des ARN et une
des étapes les plus cruciales concernant le rendement et la qualité des ARN isolés.
Généralement, la désintégration cellulaire doit être rapide et approfondie. Une
désintégration lente, par exemple en plaçant les cellules ou les tissus dans une solution de
lyse à l'isothiocyanate de guanidine (GITC) pendant une période prolongée avant la
sonification, peut entraîner une dégradation des ARN par libération interne des ARNases.
Ceci pose particulièrement un problème pour le traitement de tissus contenant beaucoup
d'ARNases tels que la rate ou le pancréas.
La désintégration de tissus congelés nécessite plus de temps et d'efforts que le traitement
de tissus frais, mais la congélation des échantillons est parfois nécessaire. Les
échantillons sont généralement congelés quand 1) ils sont récupérés sur une période
prolongée et ne peuvent par conséquent pas être traités simultanément, 2) il y a de
nombreux échantillons, 3) les échantillons sont prélevés sur le terrain, ou 4) le traitement
mécanique des échantillons frais est insuffisant pour une désintégration approfondie. Un
mortier et un pilon ou un sac et un marteau sont généralement utilisés lorsque le produit
de départ est congelé. L'ARN reste intact dans les tissus pendant une journée à 37ºC, une
semaine à 25ºC et un mois à 4ºC, et indéfiniment à des températures inférieures à zéro.
Avec le traitement par ultrasons, l'agitation moléculaire dans l'échantillon provoque
généralement une élévation de température, surtout avec de petits volumes. Les
températures élevées réduisant la cavitation, la température de l'échantillon doit être
conservée aussi basse que possible - de préférence juste au-dessus de son point de
congélation. Ceci peut être réalisé en immergeant le récipient contenant l'échantillon dans
un bain de glace et d'eau salée. L'élévation de température peut également être réduite en
utilisant le pulseur.
La désintégration des cellules peut être améliorée en augmentant la pression
hydrostatique (habituellement 1 à 4 bar [15 - 60 psi]) et la viscosité. Pour les micro-
organismes, l'addition de billes de verre d'une taille comprise entre 0,5 et 1 mm favorise
la désintégration des cellules. Les billes sont pratiquement indispensables pour la
désintégration de spores ou de levures. Le bon dosage est de un volume de billes pour
deux volumes de liquide. Les billes de verre sont disponibles chez Cataphote, Inc. P.O.
Box 2369, Jackson, Mississippi 39225-2369 USA, téléphone (800) 221-2574 ou (601)
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