Sonics VCX134PB - Manuel (Page 20)

des tissus végétaux contiennent généralement des polysaccharides et des poly-phénols
pouvant co-précipiter avec l'ARN et inhiber les tests en aval. Le traitement d'un lysat de
tissu végétal avec du polyvinylpyrrolidone (PVP) permet de faire précipiter ces
composants problématiques pour les extraire du lysat avant d'effectuer la purification
d'ARN réelle.
Chaque fois que cela est possible, les tissus doivent être coupés en tout petits morceaux
pour permettre leur mouvement dans le liquide. Les tissus résistants comme la peau et les
muscles doivent d'abord être liquéfiés dans un mixer ou un équivalent pendant environ 10
secondes, et transvasés dans un petit récipient pendant le traitement ultrasonique. Si
l'utilisateur désire des particules sub-cellulaires intactes, régler la commande d'amplitude
assez bas et augmenter le temps de traitement.
Les levures peuvent être extrêmement difficiles à désintégrer car leur paroi cellulaire peut
former des capsules ou des spores presque indestructibles. Pour traiter des levures,
soniquer dans un tube contenant l'échantillon, du tampon de lyse à base de guanidine et
des petites billes de verre (0,5 – 1 mm). Un pré-traitement à la zymolase, glucalase et / ou
lyticase pour donner des sphéroplastes pouvant être facilement lysés peut être utile.
Pour désintégrer les champignons filamenteux, gratter le mycélium dans un mortier froid,
ajouter de l'azote liquide et broyer avec un pilon pour obtenir une poudre fine. La poudre
peut ensuite être soigneusement soniquée dans du tampon de lyse pour la solubiliser
complètement. Comme les champignons peuvent également être riches en
polysaccharides, un pré-traitement au polyvinylpyrrolidone (PVP) peut être bénéfique.
Les bactéries, comme les plantes, sont extrêmement diverses ; par conséquent, il est
difficile d'émettre une recommandation applicable à toutes les bactéries. Un traitement
ultrasonique lysera la plupart des bactéries Gram Positives et Gram Négatives, y compris
les mycobactéries. Bien qu'il soit conseillé d'utiliser des billes de verre et une solution de
lyse, il est possible de lyser certaines bactéries Gram Négatives en les soniquant dans la
solution de lyse sans billes. Les parois cellulaires des bactéries nécessitent une digestion
plus rigoureuse et des temps de traitement plus longs. Les sphéroplastes sont ensuite lysés
par sonification dans du tampon de lyse GITC.
Les désintégration de cellules trouvées dans les sols et les sédiments peut se faire de deux
façons. Une technique isole les cellules bactériennes du reste avant d'isoler l'ARN. Ceci
se fait en homogénéisant le sol humide dans un homogénéisateur mécanique suivi par une
centrifugation à basse vitesse pour extraire la biomasse fongique et les débris du sol. Le
surnageant est à nouveau centrifugé à une plus grande vitesse pour sédimenter les cellules
bactériennes. Les cellules peuvent ensuite être lysées comme décrit précédemment pour
les bactéries. D'autres techniques décrivent l'extraction d'ARN directement à partir du sol
ou des sédiments. Par exemple, une méthode nécessite de mélanger le sol avec de la terre
de diatomée et du tampon de lyse, puis de soniquer. L'échantillon est ensuite centrifugé
pour retirer les débris solides.
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